Biofilm jest skupiskiem jednego lub wielu gatunków drobnoustrojów, które pokryte są macierzą stanowiącą fizyczną barierę chroniącą bakterie przed substancjami bójczymi. Pokrywa większość trudno gojących się ran i jest jednym z największych wyzwań terapeutycznych. W jaki sposób należy postępować z biofilmem? Jakie są skuteczne strategie działania?
Autor: dr n. med. i n. o zdr. Elżbieta Szkiler, pielęgniarka, ekspertka w dziedzinie leczenia ran
W XVII wieku odkryto pierwszy biofilm pochodzący sprzed 3,4 miliarda lat. Z kolei pierwszy biofilm w erze nowożytnej odkryto w roku 1985 w szwach chirurgicznych, ale dopiero w roku 2008 potwierdzono jego obecność w ranach przewlekłych. w tej chwili biofilm opisuje się jako wielowarstwową, i najczęściej wielogatunkową, strukturę drobnoustrojów otoczoną matrixem (substancją egzopolimerową, ang. extracellular polymeric substances – EPS), przytwierdzoną trwale do podłoża, w tym do łożyska rany.
Z czego składa się biofilm?
Drobnoustroje stanowią tylko 20% matrixa, który zbudowany jest z trzech warstw o różnej konsystencji:
- zewnętrzna warstwa biofilmu, która zawiera bakterie tlenowe,
- środkowa warstwa biofilmu, która zawiera bakterie względne – beztlenowce,
- dolna warstwa biofilmu, która zawiera bakterie beztlenowe.
Bakterie usytuowane w tkance są w uśpieniu metabolicznym i blokują dostęp antybiotykom, wytwarzają oporność.
Matrix otaczający bakterie biofilmowe zawiera 97% wody, liczne egzopolimery zależnie od rodzaju bakterii, egzopolisacharydy, białka (enzymy i lektyny), kwasy nukleinowe (zewnątrzkomórkowe DNA), glikoproteiny, lipidy oraz kwasy tejchojowe i lipotejchojowe (gdy obecne są bakterie Gram dodatnie) i lipopolisacharydy (jeśli są obecne bakterie Gram ujemne).
Biofilm in vivo jest niewielkiej wielkości, w tkankach jego grubość może wynosić 4–200 μm, a na wyrobach medycznych, np. cewnikach rurkach i na powierzchniach stałych – 5–1200 μm. Jednak najczęściej jego grubość wynosi 0,2-1,0 μm, a często jest zdecydowanie cieńsza – 10-30 nm, szczególnie w ranach ostrych (1 μm =1000nm). Grubość biofilmu wytworzonego przez bakterie z gatunku P. aeruginosa może osiągnąć 209 μm; S. aureus – 8,0 μm; oraz K. pneumoniae – 231 μm.
Bakterie planktoniczne/luźno pływające w ciągu kilku minut po kontaminacji zmieniają swój fenotyp DNA i ekspresję genów zmieniając się w bakterie biofilmowe/osiadłe.
W jaki sposób biofilm wpływa na gojenie się ran?
Ocenia się, iż 60-100% ran niegojących się jest pokrytych biofilmem.
Biofilm w ranach rozwija się w tkance wcześniej uszkodzonej i w obecności klinicznych objawów zapalenia, produkuje proteazy, podwyższa poziom metaloproteaz macierzy i elastazy neutrofilowej oraz zwiększa stres oksydacyjny, wywołuje hipoksję i zwiększa uszkodzenia tkanek. Biofilm wywołuje przewlekły stan zapalny o podłożu immunologicznym, wysoki poziom proteaz bakteryjnych i gospodarza niszczy receptory czynnika wzrostu i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej niezbędne do gojenia rany.
Biofilm w ranach ostrych zaczyna się rozwijać w ciągu kilku minut po kolonizacji bakterii planktonicznych i jest utworzony przez bakterie Gram dodatnie. Biofilm w ranach przewlekłych zaczyna się rozwijać od poziomu 107CFU/g tkanki, opóźnienie produkcji biofilmu jest spowodowane stałym stresem oksydacyjnym u osób chorych przewlekle. W tych ranach biofilm najczęściej jest utworzony przez mieszane bakterie Gram dodatnie i Gram ujemne.
W pełni odporny biofilm bakterii Pseudomonas aeruginosa tworzy się 5 godzin, a w przypadku innych drobnoustrojów, w przeciągu 24-48 godzin.
Biofilm jest wysoko tolerancyjny wobec odpowiedzi immunologicznej gospodarza (limfocyty i neutrofile) i unika fagocytozy przez komórki żerne(makrofagi). Bakterie biofilmowe są 100-1000 razy bardziej odporne na działanie antybiotyków i antyseptyków niż bakterie planktoniczne.
Na rodzaj drobnoustrojów, w tym biofilmowych w ranie, ma wpływ lokalizacja rany i stan rany a nie jej etiologia. Biofilm jest obecny w wysięku na powierzchni rany i w tkankach w łożysku rany, w tkance martwiczej pokrywającej łożysko i w opatrunkach, zawsze pokrywa ranę nierównomiernie.
Jak tworzy się biofilm?
Biofilm tworzy w ranie śliską, półprzezroczystą i błyszczącą warstwę niewidoczną gołym okiem, tylko osoba o wysokich umiejętnościach praktycznych i szerokiej wiedzy merytorycznej może wskazać obecność biofilmu w badaniu rany. Natomiast przy niezakłóconym rozwoju biofilmu tworzy się widoczna gołym okiem, podobna do fibryny warstwa.
Biofilm szybciej rozwija się u osób z cukrzycą, niewydolnością żylną , niedożywionych, z nowotworem, w przebiegu obrzęków, w powtarzających się urazach tkanek i w przypadku upośledzonej odpowiedzi układu immunologicznego.
Biofilm jest odwracalny tylko w ciągu 2 godzin od kolonizacji, po upływie 2 godzin od momentu kolonizacji i uzyskaniu przyczepności jest nieodwracalny. Rozwija się w ciągu 6 godzin od kolonizacji, w pełni odporny jest po 24-48 godzinach, ale już po 2 godzinach blokuje dostęp środków przeciwdrobnoustrojowych (antybiotyków i antyseptyków) do łożyska rany w której jest osadzony. Rozwój biofilmu zwiększa kliniczne objawy zapalenia w tkance (akronim STONNES).
Oporność biofilmu na działania zwalczające
Biofilm jest wysokoodporny na środki przeciwdrobnoustrojowe w tym biocydy i antybiotyki, promieniowanie UV, toksyczność metali, np. srebro i tlenek miedzi, antyseptyki, niedobór tlenu, ekspozycję na kwasy i wahania pH, zasolenie, wysuszenie, bakteriofagi i ameby.
Biofilm jest oporny na działania zwalczające ze względu na kilka czynników:
- przyczepność bakterii do tkanki ułatwiają białka macierzy – fibrynogen, fibronektyna i kolagen obecne w łożysku rany;
- rozwój biofilmu ułatwia i warunkuje porozumiewanie chemiczne (enzymatyczne) drobnoustrojów – Quorum sensing(QS);
- biofilm zużywa tlen w tkance, którą pokrywa i wywołuje jej niedotlenienie/hipoksję, zużywa składniki odżywcze w tkance, szczególnie glukozę i jony metali – wapń i magnez wykorzystuje do budowy matrixa, a mangan i żelazo do własnego przeżycia;
- źle kontrolowany wysięk w ranie sprzyja kolonizacji bakterii biofilmowych;
- biofilm podnosi pH łożyska rany do 12, co unieczynnia związki srebra, szczególnie srebro jonowe;
- QS chroni bakterie biofilmowe przed działaniem białych krwinek/leukocytów – limfocytów, neutrofili i makrofagów, antyseptyków i antybiotyków;
- matrix biofilmu sekwestruje (włącza w swój cykl życiowy) i degraduje środki przeciwdrobnoustrojowe, reguluje populację, gęstość i aktywność metaboliczną bakterii;
- wspólny biofilm Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus wywołuje mniejsze objawy kliniczne i niższe markery zapalenia niż kolonizacja innych bakterii, ale bardzo skutecznie opóźnia gojenie. Staphylococcus aureus we wspólnym biofilmie jest położony na Pseudomonas aeruginosa, który zawsze się skrywa w tkance.
Jak postępować z biofilmem?
Wymaz z rany pokrytej biofilmem może być ujemny, ale najczęściej wskazuje tylko bakterie wierzchniej zewnętrznej warstwy matrixa. Diagnostyka bakterii biofilmowych wymaga pobrania biopsji tkanek lub wyskrobin z łożyska rany.
Antybiotyki są skuteczne wobec bakterii planktonicznych, natomiast struktura biofilmu jest skuteczną barierą dla antybiotyków, a stosowane w leczeniu biofilmu antybiotyki uszkadzają florę fizjologiczną pacjenta umożliwiając ponowną kolonizację bakteriom oportunistycznym i wytworzenie oporności na antybiotyki, czasem zwiększają masę biofilmu szczególnie przez bakterii Pseudomonas aeruginosa.
Tylko oczyszczanie mechaniczne może usunąć biofilm i zwiększa w ciągu 24 godzin wrażliwość bakterii na środki przeciwdrobnoustrojowe. Niewłaściwie zastosowany opatrunek powoduje powrót biofilmu po 24 godzinach od oczyszczenia mechanicznego i 72 godzinach od oczyszczenia chirurgicznego. Udowodniono natomiast skuteczność przeciwbiofilmową dla 0,1% EDTA (usuwa jony metali z matrixa), a także kwasu octowego, kwasu cytrynowego i karbopolu (rozpuszczalny polimer karboksylowy poliwinylu) w tym wobec biofilmu P. aeruginosa i S. epidermidis, ale ich skuteczność zwiększa się po ostrym oczyszczaniu łożyska rany.
W leczeniu biofilmu należy uniemożliwić ponowną kolonizację bakterii, prowadzić regularne, dokładne i powtarzalne oczyszczanie ostre oraz przerwać lub hamować sygnał QS, skuteczna likwidacja biofilmu wymaga obniżenia pH łożyska rany <4,3.
Bakterie w metabolicznym uśpieniu są bardziej tolerancyjne na tobramycynę i jony srebra a bakterie aktywne w górnej warstwie biofilmu są bardziej tolerancyjne na działanie chloru(roztwory ponadtlenkowe)
Bakterie Pseudomonas aeruginosa po pozornie skutecznej antybiotykoterapii może przetrwać w tkankach do 2 lat po wygojeniu ran.
Bakterie są zawsze wrażliwe na miody medyczne i chitozan (oba obniżają pH) a po obniżeniu pH także na maść z żywicy, nigdy nie wytwarzają na te preparaty oporności.
Piśmiennictwo
Antimicrobial Stewardship to Guide Wound Management Practices: A Case Series. Ostomy Wound Management 2018;64(8):18–28
Bjarnsholt T., Schultz G., Kirketerp-Møller K., Fletcher J., Malone M. The role of biofilms in delayed wound healing. World Union of Wound Healing Societies (WUWHS). Florence Congress. Position Document. Management of Biofilm. Wounds International 2016:4-9
Bowler P.G. Antibiotic resistance and biofilm tolerance: a combined threat in the treatment of chronic infections. JOURNAL OF WOUND CARE VOL 27, NO 5, MAY 2018: 273-277
Bowler P.G., Parsons D. Combatting wound biofilm and recalcitrance with a novel anti-biofilm Hydrofiber1 wound dressing. Wound Medicine 14 (2016) 6–11
Chung P.Y., Toh Y.S. Pathogens and Disease (2014), 70, 231–239
de la Fuente-Núñez C., et al. Synthetic antibiofilm peptides, Biochim. Biophys. Acta (2015), http://dx.doi.org/10.1016/ j.bbamem.2015.12.015. BBAMEM-82074; No. of pages: 9; 4C: 3, 6
Francolini I., Donelli G. Preventionand control of biofilm-basedmedical-device-related infections. FEMS Immunol Med Microbiol 59 (2010) 227–238
Gottrup F., Apelqvist J., Bjansholt T., CooperR., Moore Z., Peters E.J.G., Probst S. EWMA Document: Antimicrobials and Non-healing Wounds Evidence, controversies and suggestions. Journal of Wound Care Vol 2 2 . No 5 . EWMA Documen t 2013
Gutwein L.G., Panigrahi M., Schultz G.S., Mast B.A. Microbial Barriers. Clin Plastic Surg 39 (2012) 229–238 doi:10.1016/j.cps.2012.04.002
Hill R., Rennie M.Y., Douglas J. Using Bacterial Fluorescence Imaging and
Høiby N., Bjarnsholt T., Moser C. et al. ESCMID* guideline for the diagnosis and treatment of biofilm infections 2014. ESCMID GUIDELINES VOLUME 21, SUPPLEMENT 1, S1-S25, MAY 01, 2015 DOI:https://doi.org/10.1016/j.cmi.2014.10.024
Hughes G., Webber M.A. Novel approaches to the treatment of bacterial biofilm infections. British Journal of Pharmacology (2017) 174 2237–2246
Ikram R. Microbiological assessment of infected Wounds . Best Tests | June 2013 | 2-9
Kamaruzzaman N.F., Tan L.P. , Yazid K.A.M., Saeed S.I., Hamdan R.H., Choong S.S. ,Wong W.K. , Chivu A., Gibson A.J. Targeting the Bacterial Protective Armour; Challenges and Novel Strategies in the Treatment of Microbial Biofilm. Materials 2018, 11, 1705; doi:10.3390/ma11091705
Metcalf D., Bowler P., Parsons D. Wound Biofilm and Therapeutic Strategies. http://dx.doi.org/10.5772/63238 Chapter 14 :271-298
Metcalf D.G., Bowler P.G. Biofi lm delays wound healing: A review of the evidence. Burns & Trauma, June 2013, Vol 1, Issue 1: 5-12
Moryl M. Egzopolimery macierzy biofilmu jako czynniki wirulencji mikroorganizmów w rozwoju chorób człowieka. Postepy Hig Med Dosw (online), 2015; 69: 1485-1498
Paladini F.,Pollini M.,Sannino A.,Ambrosio L. Progress and Perspectives in the Management of Wound Infections. Wound Healing – New insights into Ancient Challenges. 2016:436-456. http://dx.doi.org/10.5772/64280
Parsons D., Metcalf D. Understanding local barriers to wound healing. Next-generation antimicrobial dressings: AQUACEL Ag+ Extra and Ribbon. London: Wounds International, 2014 (Suppl): 1-5 . Available to download from: www. woundsinternational.com;
Percival S.L., Finnegan S., Donelli G., Vuotto C., Rimmer S., Lipsky B.A. Antiseptics for treating infected wounds: Efficacy on biofilms and effect of pH. Crit Rev Microbiol, Early Online: 1–17. 2014 Informa Healthcare USA, Inc. DOI: 10.3109/1040841X.2014.940495
Sadekuzzaman M., Yang S., Mizan M.F.R.,Ha S.D. Current and Recent Advanced Strategies for Combating Biofilms. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol. 14, 2015
Satpathy S., Sen S.K., Pattanaik S., Raut S. Reviewonbacterialbiofilm: An universal cause of contamination. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 7 (2016) 56–66
Schultz G., A comprehensive biofilm-based management approach Improving standard care for all wound types. Wounds June 2016 titled: Expert Recommendations for Optimizing Outcomes in the Management of Biofilm to Promote Healing of Chronic Wounds. Wounds. 2016;28[suppl 6]:S1-S20).
Schultz G.,Bjarnsholt T.,James G.A.,Leaper D.J.McBain A.J.,Malone M., Stoodley P.,Swanson T., Tachi M., Wolcott R.D., for the Global Wound Biofilm Expert Panel. Consensus guidelines for the identification and treatment of biofilms in chronic nonhealing wounds. Wound Healing Society. Wound Rep Reg (2017) 25 744–757
Serra R., Grande R., Butrico L., Rossi A., Settimio U.F., Caroleo B., Amato B., Gallelli L., de Franciscis S. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Rev. Anti Infect. Ther. Early online, 1–9 (2015)
Swanson T., Angel D., Sussman G.,Cooper R.,Haesler E.,Ousey K.,Carville K.,Fletcher J,Kalan l., Keast D.,Leaper D.,Schultz G.,Black J.,Call E. Wound Infection in Clinical Practice. Principles of best practice. International Consensus Update 2016. International Wound Infektion Institute
Tyldesley H.Ch., Salisbury A-M., Chen R., Mullin M., Percival S.L. Surfactants and their role in biofilm management in chronic wounds. Wounds International 2019 10 | Vol 10 Issue 1:20-24
Wolcott R.D., James G., Schultz G., Yang, Q., Watters C., Dowd S.E. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a timedependent therapeutic window. Journal of Wound Care vol 19 , no 8 , august 2 0 1 0 :320-328
Wolcott R.D.,Cox, S. The effects of a hydroconductive dressing on wound biofilm. Wound Healing Southern Africa 2016;9(2):18-20
