Kolonizacja bakteryjna skóry stanowi złożony i dynamiczny proces, którego przebieg zależy od integralności bariery naskórkowej, odporności miejscowej oraz składu mikrobiomu. W przypadku uszkodzeń skóry, np. ran, równowaga między mikroorganizmami a gospodarzem zostaje zachwiana, co może prowadzić do nadkażeń i zaburzeń gojenia. Tradycyjne techniki mikrobiologiczne — wymazy czy biopsje — pozwalają określić obecność bakterii, ale nie oddają ich rozmieszczenia w przestrzeni. Nowatorska metoda – Bactogram- wypełnia tę lukę, umożliwiając wizualizację i ilościową analizę przestrzennej dystrybucji bakterii w obrębie skóry i ran. Technika ta została opracowana przez zespół K. Wallblom`a i stanowi przełom w ocenie mikrobiologicznej powierzchni skóry.
Metoda Bactogram — zasada i procedura
Założenia koncepcyjne
Metoda Bactogram została zaprojektowana jako dwuwymiarowa mapa bakteryjnej kolonizacji powierzchni skóry lub rany. Celem nie jest jedynie stwierdzenie obecności mikroorganizmów, ale określenie ich rozmieszczenia i intensywności kolonizacji w różnych obszarach — centralnej części rany, brzegach oraz otaczającym naskórku.
W przeciwieństwie do wymazów punktowych, Bactogram pozwala na przeniesienie całego obrazu mikrobiologicznego badanej powierzchni, co daje znacznie bardziej reprezentatywny wynik.
Jak powstaje Bactogram?
Technika opiera się na metodzie odcisku (ang. imprint method), w której specjalnie przygotowany filtr papierowy — zwilżony sterylnym buforem — przykładany jest do powierzchni skóry lub rany. W wyniku kontaktu dochodzi do adhezji bakterii do powierzchni filtru, który następnie przenoszony jest bezpośrednio na agarową pożywkę hodowlaną. Po okresie inkubacji uzyskuje się „mapę kolonii bakteryjnych”, odzwierciedlającą przestrzenne rozmieszczenie mikroorganizmów.
Wizualna reprezentacja po inkubacji stanowi tzw. bactogram, który można następnie analizować jakościowo (wizualnie) lub ilościowo (cyfrowo, dzięki analizy obrazu).
Etapy procedury badawczej
Przygotowanie materiałów
- Filtr papierowy – używany jest wysokiej jakości filtr celulozowy lub nitrocelulozowy, który zapewnia równomierne przyleganie i przenoszenie bakterii.
- Bufor nawilżający – najczęściej stosuje się fosforanowy bufor soli (PBS) o neutralnym pH 7,4, co minimalizuje stres osmotyczny i pozwala na zachowanie żywotności bakterii.
- Pożywki hodowlane – stosuje się agar nieselektywny (np. TSA – Tryptic Soy Agar) dla uzyskania ogólnej kolonizacji, ale w badaniach walidacyjnych wykorzystano też pożywki chromogeniczne do identyfikacji Staphylococcus aureus.
Przygotowanie powierzchni skóry lub rany
Skóra pacjenta powinna być sucha, pozbawiona opatrunku i oczyszczona z nadmiaru wydzieliny. W badaniu klinicznym metodą Bactogram analizowano rany pęcherzowe (suction blisters), które stanowiły model kontrolowanego uszkodzenia naskórka. Przed wykonaniem odcisku każda rana była klasyfikowana według fazy gojenia (dzień 2, 5, 7, 10), co umożliwiało ocenę dynamiki kolonizacji.
Wykonanie odcisku
- Zwilżony filtr przykładano delikatnie do skóry (ok. 120 cm² powierzchni), obejmując zarówno ranę, jak i skórę otaczającą.
- Czas kontaktu wynosił ok. 10–15 sekund, a nacisk był równomierny, aby nie uszkodzić tkanek i zapewnić równomierny transfer bakterii.
- Po zdjęciu filtru nanoszono jego powierzchnię stroną kontaktową na agarową płytkę.
Ten etap ma największe znaczenie, ponieważ dokładność i równomierność odcisku determinują późniejszą czytelność obrazu kolonii. Badacze zwracali uwagę, iż istotne jest utrzymanie identycznego nacisku i czasu aplikacji, aby zapewnić powtarzalność wyników.
Transfer i inkubacja
Filtr papierowy przykładano bezpośrednio do pożywki agarowej na 30–60 sekund, co umożliwiało przejście części bakterii z powierzchni filtru na pożywkę.
Płytki inkubowano w temperaturze 35–37 °C przez 24–48 godzin. Po tym czasie powstawały wyraźne kolonie, które odwzorowywały układ bakterii na powierzchni skóry.
W celu uniknięcia zniekształceń po inkubacji płytek nie przemieszczano, a zdjęcia wykonywano bezpośrednio w komorze inkubacyjnej.
Dokumentacja fotograficzna
Uzyskany obraz kolonii utrwalano fotograficznie w świetle rozproszonym. W przypadku pożywek chromogenicznych kolor kolonii wskazywał potencjalny gatunek bakterii. Dla standaryzacji każdy obraz skalowano w taki sposób, by powierzchnia odpowiadała rzeczywistej wielkości badanego obszaru skóry.
Analiza obrazu
Analizę przeprowadzano dwiema metodami:
- ocena wizualna
Dwóch niezależnych obserwatorów przyznawało stopnie kolonizacji w poszczególnych strefach (rana, brzeg rany, skóra otaczająca) według pięciostopniowej skali:
0 – brak kolonii,
1 – pojedyncze kolonie,
2 – umiarkowana liczba kolonii,
3 – liczne kolonie z tendencją do zlewania,
4 – pełne pokrycie powierzchni.
Oceny uzgadniano w drodze konsensusu, co zwiększało wiarygodność danych. - analiza cyfrowa
Obrazy przetwarzano w programie ImageJ (NIH, USA). W pierwszym kroku konwertowano je do skali binarnej (kolonia = piksel czarny, tło = piksel biały). Następnie wyznaczano procentowy udział pikseli kolonijnych w każdej z trzech stref, a wyniki zestawiano z klasycznymi pomiarami CFU/cm² uzyskanymi z wymazów.
Korelacja między metodami wynosiła ok. 0,6–0,7 (r = 0,64, p < 0,001), co potwierdza wysoką zgodność ilościową.
Opracowanie przestrzennego profilu kolonizacji
Wyniki analizy komputerowej umożliwiały przedstawienie kolonizacji w formie mapy cieplnej, gdzie kolor odpowiadał intensywności bakteryjnej obecności (np. czerwony – wysoka, żółty – umiarkowana, niebieski – niska). Pozwalało to ocenić, które strefy rany były najbardziej skolonizowane i jak ten rozkład zmieniał się w czasie gojenia.
Wyniki i obserwacje
Bactogram pozwolił na wizualizację ewolucji kolonizacji bakteryjnej w czasie gojenia ran. Najwyższe zagęszczenie bakterii obserwowano w pierwszych dniach w obrębie brzegów rany oraz pod opatrunkiem, co potwierdza teorię, iż środowisko o podwyższonej wilgotności sprzyja namnażaniu drobnoustrojów. Z czasem kolonizacja przemieszczała się ku centrum rany, jednak jej nasilenie malało wraz z regeneracją naskórka.
Uzyskane dane potwierdziły, iż Bactogram może stanowić cenne narzędzie w ocenie skuteczności preparatów przeciwbakteryjnych, opatrunków aktywnych oraz terapii wspomagających gojenie ran.
Czy wizualna analiza przestrzennego rozkładu bakterii ma przyszłość?
Metoda Bactogram wnosi nową jakość do badań nad mikrobiotą skóry. Umożliwia przestrzenną ocenę bakterii, co dotychczas było praktycznie niemożliwe w warunkach klinicznych. Jej niewątpliwą zaletą jest możliwość objęcia dużego obszaru oraz wizualnego porównania kolonizacji między różnymi strefami. Połączenie z analizą komputerową daje również wymiar ilościowy, co ułatwia standaryzację.
Do ograniczeń należą m.in.:
- preferencyjny wzrost bakterii szybkorosnących,
- brak możliwości detekcji mikroorganizmów niekulturowych,
- zmienność międzyosobnicza w zakresie mikrobiomu skóry.
Mimo tych ograniczeń Bactogram jest metodą tanią, powtarzalną i niezwykle obiecującą jako narzędzie wspomagające diagnostykę ran przewlekłych i badania kliniczne nad terapiami antybakteryjnymi.
Podsumowanie
Bactogram to innowacyjna metoda umożliwiająca wizualną analizę przestrzennego rozkładu bakterii w obrębie naskórka i ran. Pozwala lepiej zrozumieć proces kolonizacji mikrobiologicznej oraz ocenić skuteczność terapii miejscowych. Dzięki prostocie wykonania i wysokiej powtarzalności ma potencjał, by stać się standardowym narzędziem w badaniach nad mikrobiotą skóry i procesami gojenia.
Bibliografia
